پروتئین OCLN نقش مهمی در انتقال سلول به سلول SARS-CoV-2 ایفا می کند.

در مطالعه اخیر منتشر شده در مجله PNASمحققان نشان دادند که اتصال محکم (TJ) پروتئین اکلودین (OCLN) برای سندرم حاد تنفسی ویروس کرونا 2 (SARS-CoV-2) با واسطه انتقال مستقیم سلول به سلول در داخل میزبان حیاتی است.

مطالعه: پروتئین اتصال محکم اکلودین یک عامل داخلی سازی برای عفونت SARS-CoV-2 است و واسطه انتقال ویروس از سلول به سلول است. اعتبار تصویر: Naeblys / Shutterstock

زمینه

انتقال ویروس از طریق تماس محکم سلول به سلول، اثربخشی داروهای ضد ویروسی را کاهش می دهد و به ویروس ها کمک می کند تا از آنتی بادی های خنثی کننده (nAbs) فرار کنند. مطالعات نشان داده‌اند که بسیاری از ویروس‌های انسانی، از جمله SARS-CoV-2، آنفلوانزا A و ویروس سنسیشیال تنفسی (RSV)، از این مکانیسم، ذرات بدون سلول یا هر دو برای ایجاد عفونت و زنده ماندن در میزبان استفاده می‌کنند.

مطالعات قبلی همچنین تشکیل سینسیشیا در بافت های ریه انسان را با SARS-CoV-2 مرتبط کرده است. در SARS-CoV-2 و سایر کروناویروس‌ها (CoVs)، به عنوان مثال، سندرم تنفسی خاورمیانه (MERS-CoV)، تشکیل سینسیتیا به افزایش انتقال مستقیم سلول به سلول کمک می‌کند. با این حال، عوامل میزبان درگیر در این فرآیند و مکانیسم‌های اساسی انتشار سلول به سلول SARS-CoV-2 ناشی از گلیکوپروتئین S نامشخص است.

سلول های اپیتلیال در مجاری هوایی انسان دارای ساختارهای بین سلولی به نام TJ هستند که عبور یون ها و املاح کوچک را تنظیم می کنند. آنها همچنین به عنوان اولین مانع برای پاتوژن ها عمل می کنند. TJ ها حاوی پروتئین OCLN هستند که به عنوان یک عامل میزبان حیاتی برای ورود چندین ویروس به داخل میزبان انسانی، به عنوان مثال، روتاویروس و ویروس هپاتیت C شناخته شده است.

از آنجایی که ادغام سلول های آلوده به ویروس ناشی از ویروس با سلول های مجاور و ایجاد سینسیتیا مستلزم شکستن سد بین سلولی است، محققان حدس زدند که پروتئین های TJ ممکن است در گسترش SARS-CoV-2 از طریق انتقال سلول به سلول دخیل باشند. .

در مورد مطالعه

در مطالعه حاضر، محققان اثر عفونت SARS-CoV-2 را بر روی پروتئین های TJ مورد بررسی قرار دادند که به آنها کمک کرد تا نقش ناشناخته قبلی OCLN را به عنوان یک عامل داخلی سازی منشاء میزبان برای ورود SARS-CoV-2 و متعاقب آن سلول به-سلول کشف کنند. انتقال سلول در سلول های میزبان آنها از سلول های Vero-E6 آلوده به ویروس استوماتیت تاولی دارای قابلیت تکرار (rVSV) استفاده کردند که پروتئین فلورسنت سبز (eGFP) و SARS-CoV-2 S (rVSV-eGFP-S) را بیان می کرد و همچنین از یک SARS-CoV-2 نوترکیب استفاده کردند. بیان ژن mNeonGreen برای تعیین توزیع OCLN در سلول های Vero-E6 آلوده.

وسترن بلات تایید کرد که عفونت توسط هر دو نوترکیب بیان OCLN را تغییر می دهد. بر این اساس، سطوح OCLN 48 ساعت پس از عفونت (pi) در سلول‌های Vero-E6 آلوده غیرقابل تشخیص شد. این تیم همچنین این نتایج را در سلول‌های A549-hACE2 مشتق از انسان و مدل عفونت SARS-CoV-2 همستر تأیید کرد.

سپس، تیم تعیین کرد که آیا سلول‌های مجاز، به عنوان مثال، سلول‌های Vero-E6 و A549-hACE2، برای ایجاد عفونت SARS-CoV-2 نیز به OCLN نیاز دارند یا خیر. بنابراین، آن‌ها سلول‌های Vero-E6 را با دو RNA مداخله‌گر کوچک (siRNA) با هدف OCLN ترانسفکت کردند که به آن‌ها کمک کرد بیان OCLN را با استفاده از روش ایمونوفلورسانس (IFA) و واکنش زنجیره‌ای ترانس کریپتاز-پلیمراز معکوس کمی (RT-qPCR) تأیید کنند. علاوه بر این، محققان برای تجسم تعامل OCLN با پروتئین SARS-CoV-2، سنجش هم‌ایمنی رسوب‌گذاری (co-IP) را انجام دادند.

OCLN یک پروتئین گذرنده با حوزه های چهار مارپیچ است، به عنوان مثال، یک دامنه N ترمینال داخل سلولی، یک دم سیتوپلاسمی بلند، همچنین به عنوان ترمینال C، دو حلقه خارج سلولی، EL1 و EL2 که از طریق یک حلقه کوتاه داخل سلولی به هم متصل شده اند، شناخته می شود. بنابراین، در نهایت، محققان تعیین کردند که کدام دامنه OCLN برای درونی سازی SARS-CoV-2 و انتقال سلول به سلول حیاتی است.

برای این منظور، تیم چهار ساختار حذف OCLN، یعنی hOCLN/ΔC، hOCLN/ΔE1، hOCLN/ΔE2 و hOCLN/ΔN ساختند و آنها را به رده سلولی OCLN KO Vero-E6 انتقال دادند. سپس بیان هر کدام را با استفاده از وسترن بلات و IFA تایید کردند.

نتایج

این مطالعه نشان داد که OCLN، یک عامل میزبان، درونی‌سازی SARS-CoV-2 و متعاقب آن انتقال سلول به سلول را واسطه می‌کند. بنابراین، نابودی آن باعث کاهش انتشار SARS-CoV-2 شد، در حالی که بیان بیش از حد آن در آزمایش‌هایی با rVSV‌هایی که پروتئین‌های S را از چندین گونه SARS-CoV-2 بیان می‌کردند، ترویج کرد. درونکشتگاهی و in vivo عفونت SARS-CoV-2 به طور قابل توجهی کاهش یافت و در نهایت OCLN را به طور کامل از بین برد.

همه rVSV‌هایی که پروتئین‌های S را از گونه‌های دلتا، بتا و کاپا SARS-CoV-2 بیان می‌کنند، انتقال سلول به سلول را نسبت به سویه WA-1 نشان دادند. انواع گاما و آلفا توانایی های قابل مقایسه ای را برای ایجاد سینسیتیوم به عنوان سویه WA-1 نشان دادند. به طرز جالبی، Omicron ظرفیت قابل توجهی برای تشکیل سینسیتیا در سلول‌های A549-hACE2 نسبت به سایر گونه‌های SARS-CoV-2 و WA-1 نشان داد، که نشان می‌دهد Omicron توانایی محدودی برای گسترش سلول با استفاده از مسیر درون سلولی دارد. این مشاهدات همچنین توجیه می‌کند که چرا زیرشاخه‌های Omicron BA.1/BA.2 نسبت به WA-1 و سایر انواع SARS-CoV-2 علائم بالینی بی‌اهمیت ایجاد می‌کنند.

علاوه بر این، آزمایش‌های مطالعه نشان داد که عفونت SARS-CoV-2 فقط OCLN را تخریب می‌کند، اما تأثیر کمتری بر سایر پروتئین‌های TJ، به عنوان مثال، Claudin-1 دارد. مطالعات آتی باید مکانیسم‌های نهفته در مکانیسم‌های کاهش سنتز و پایداری پروتئین OCLN در TJs ناشی از SARS-CoV-2 را بررسی کنند. در سلول‌های مجاز SARS-CoV-2، از بین رفتن OCLN بر بیان آنزیم مبدل آنژیوتانسین 2 (ACE2) تأثیری نداشت، اما عفونت ویروسی را به‌طور قابل توجهی کاهش داد، به‌ویژه در مرحله درونی‌سازی و تکثیر ویروسی بعدی. برعکس، بیان بیش از حد آن به طور قابل توجهی باعث افزایش درونی و تکثیر SARS-CoV-2 شد، اما اتصال آن را افزایش نداد. بنابراین، OCLN را نمی توان یک گیرنده یا هسته گیرنده برای ورود SARS-CoV-2 در نظر گرفت.

نتایج مطالعه همچنین نشان داد که مسیر ورودی آندوزوم در انتقال سلول به سلول با واسطه SARS-CoV-2 با واسطه OCLN درگیر است. در نهایت، درمان با تریپسین به طور قابل توجهی انتقال سلول به سلول SARS-CoV-2 و تولید ویروس را در سلول‌های میزبان افزایش داد، که نشان می‌دهد این پدیده بیش از انتقال بدون سلول به حفظ عفونت‌پذیری ویروسی و قابلیت انتقال کمک می‌کند.

نتیجه گیری

مطالعه کنونی بینش‌های مکانیکی در مورد ورود SARS-CoV-2 و انتشار متعاقب آن در داخل میزبان انسان ارائه کرد. محققان دلایل قوی انتقال سلول به سلول مبتنی بر OCLN WA-1 و سایر انواع SARS-CoV-2 را که در این مطالعه مورد بررسی قرار گرفتند، ارائه کردند. در واقع، OCLN یک عامل میزبان حیاتی است که در درونی سازی SARS-CoV-2 و متعاقب آن انتقال ویروس از سلول به سلول نقش دارد.