محققان فناوری توکیو با توسعه کاوشگرهای رامان قابل فعال سازی مبتنی بر 9CN-rhodol با استفاده از یک مکانیسم جدید برای فعال سازی سیگنال رامان، نشان می دهند که تصویربرداری رامان پتانسیل بیشتری برای تشخیص فعالیت های چند آنزیمی نسبت به تصویربرداری فلورسانس ارائه می دهد. این استراتژی امکان سنتز پروب‌های رامان بسیار فعال با قابلیت تجمع و مالتی پلکس شدن بالا را فراهم می‌کند و آن را به ابزاری امیدوارکننده برای گسترش دامنه پروب‌های رامان برای تشخیص فعالیت‌های آنزیمی متعدد در بافت‌های بیولوژیکی ناهمگن تبدیل می‌کند.
دخالت آنزیم ها در طیف گسترده ای از فعالیت های بیولوژیکی آنها را به نشانگرهای زیستی ایده آل برای تشخیص بیماری ها تبدیل می کند. در واقع، فناوری‌های تشخیصی خاص سرطان از تصویربرداری فلورسانس برای تشخیص آنزیم‌های مرتبط با سرطان در سلول‌های آسیب‌دیده استفاده می‌کنند. علاوه بر این، از آنجایی که بافت‌های تومور ناهمگن هستند، شناسایی فعالیت‌های آنزیمی متعدد به طور همزمان می‌تواند به تجسم و تشخیص دقیق سرطان اجازه دهد. با این حال، ناتوانی در تشخیص فعالیت های متعدد آنزیمی به طور بالقوه می تواند کاربرد تصویربرداری فلورسانس را در بافت های تومور ناهمگن و سایر پدیده های پیچیده بیولوژیکی محدود کند.
به عنوان یک جایگزین، پهنای طیفی باریک‌تر تصویربرداری طیفی رامان امیدی را برای تصویربرداری بیولوژیکی چندگانه با کاوشگرهای مولکولی ارائه می‌کند. در طول سال‌ها، چندین پروب رامان (رنگ‌ها) کاربردی و فعال برای تشخیص بیوانالیت‌ها توسعه یافته‌اند، اما آن‌هایی که برای شناسایی فعالیت‌های آنزیمی محدود شده‌اند. علاوه بر این، استراتژی‌های طراحی قبلی در کنترل انتشار محصول هیدرولیز تولید شده توسط آنزیم این پروب‌ها شکست خورده‌اند و تشخیص مناطق با فعالیت آنزیم هدف در بافت‌ها را دشوار می‌سازد.
در مقابل این پس‌زمینه، تیمی از محققان ژاپنی به رهبری پروفسور ماکو کامیا و دستیار هیرویوشی فوجیوکا از موسسه فناوری توکیو (تکنولوژی توکیو) اخیرا با الهام از کاوشگرهای فلورسنت مبتنی بر تجمع، یک استراتژی طراحی مولکولی جدید برای سنتز پروب های رامان قابل فعال سازی بر اساس 9CN-rhodol. مطالعه آنها در مجله منتشر شد مجله انجمن شیمی آمریکا.
پروفسور کامیا در توضیح انتخاب مشتقات رودول برای داربست مولکولی می‌گوید: «هیرویوشی دریافت که مشتقات رودول با گروه نیتریل در جایگاه نهم (9CN-rhodols) و بار خالص صفر، یک قله رامان تیز را نشان می‌دهند و تجمع بیشتری دارند. توانایی در محلول آبی نسبت به 9CN-پیرونین با بار مثبت.بر این اساس، ما از رنگ‌های داربست 9CN-rhodol برای ایجاد پروب‌های رامان استفاده کردیم که می‌توانند حساسیت بالایی از خود نشان دهند و در جذب مولکولی به سمت ناحیه‌ای با اثر رامان تشدید شونده تغییر کنند و در اثر برهمکنش با آنها تجمع کنند. آنزیم های هدف.”
بر این اساس، تیم ابتدا مشتقات 9CN-rhodol را سنتز کردند و دو مشتق، 9CN-JR و 9CN-JCR را به عنوان کاندیدای طراحی پروب‌های فعال رامان انتخاب کردند. آنها سپس عملکرد تشخیص آنزیمی هر دو پروب را در سلول های زنده با استفاده از تکنیک تصویربرداری پراکندگی رامان تحریک شده با دو رنگ (SRS) آزمایش کردند. از بین این دو، 9CN-JCR به عنوان کاوشگر بهتر و درخشان‌تر برای مالتی پلکس شدن ظاهر شد.
در مرحله بعد، تیم گروه نیتریل داربست 9CN-JCR را با کربن-13 با ایزوتوپی برچسب زد.13ج) و نیتروژن-15 (15N) و سپس دو پروب 9CN-JCR ویرایش شده با ایزوتوپ جدید برای آنزیم های γ-گلوتامیل ترانس پپتیداز و دی پپتیدیل پپتیداز-4 ایجاد کرد. سپس مجموعه جدید پروب‌های مبتنی بر 9CN-JCR قادر به تشخیص همزمان فعالیت همه این آنزیم‌ها در کشت سلول‌های زنده بود.
علاوه بر این، کاوشگرها اجازه دادند ex vivo تصویربرداری از مناطق متمایز سلولی که فعالیت آنزیم هدف را بیان می کنند مگس سرکه دیسک بال و بدن چاق گزینش پذیری و حساسیت فضایی بالا نشان‌داده‌شده توسط پروب‌های 9CN-JCR به اثر پیش‌رزونانس الکترونیکی رنگ داربست و تشکیل دانه‌های محصولات هیدرولیز تشکیل‌شده توسط برهمکنش پروب-سلول هدف نسبت داده شد.
پروب‌های مبتنی بر رودول می‌توانند در واکنش با آنزیم‌ها جمع شوند، حفظ درون سلولی آنها را بهبود بخشند و شدت سیگنال SRS را در طول تشخیص آنزیم افزایش دهند.
به طور خلاصه، استراتژی آسان نشان‌داده‌شده در این مطالعه می‌تواند توسعه پروب‌های رامان قابل فعال‌سازی بسیار خاص را برای تشخیص همزمان فعالیت‌های چند آنزیمی تسهیل کند.
استراتژی طراحی مولکولی مبتنی بر تجمع ما برای کاوشگرهای رامان، مزایای قابل‌توجهی را برای کاربردهایی که شامل سرمایه‌گذاری فعالیت آنزیمی مرتبط با بیماری‌ها و فعالیت‌های بیولوژیکی ضروری است، ارائه می‌کند.
پروفسور ماکو کامیا، موسسه فناوری توکیو
این پروژه با همکاری پروفسور یاسویوکی اوزکی در دانشگاه توکیو انجام شد.
منبع:
موسسه فناوری توکیو
مرجع مجله:
فوجیوکا، اچ.، و همکاران. (2023). پروب‌های رامان فعال با استفاده از تشکیل دانه‌های ناشی از آنزیم برای انتخابی Ex Vivo تصویربرداری. مجله انجمن شیمی آمریکا. doi.org/10.1021/jacs.2c12381.