میکروسکوپ دو فوتونی (TPM) با قادر ساختن محققان به مشاهده فرآیندهای بیولوژیکی پیچیده در بافت‌های زنده با وضوح بالا، انقلابی در زمینه زیست‌شناسی ایجاد کرده است. برخلاف تکنیک‌های میکروسکوپ فلورسانس سنتی، TPM از فوتون‌های کم انرژی برای تحریک مولکول‌های فلورسنت برای مشاهده استفاده می‌کند. این به نوبه خود امکان نفوذ عمیق تر به بافت را فراهم می کند و تضمین می کند که مولکول های فلورسنت یا فلوروفورها به طور دائم توسط لیزر تحریک آسیب نبینند.
با این حال، برخی از فرآیندهای بیولوژیکی به سادگی بسیار سریع هستند، حتی با TPM های پیشرفته. یکی از پارامترهای طراحی که عملکرد TPM را محدود می کند، فرکانس اسکن خط است که به عنوان فریم در ثانیه (FPS) اندازه گیری می شود. این به سرعتی اشاره دارد که در آن نمونه هدف می تواند توسط لیزر تحریک در امتداد یک جهت (مثلاً در یک حرکت افقی) جاروب شود. فرکانس اسکن آهسته همچنین بر FPS کلی سیستم تأثیر می‌گذارد، زیرا تعیین می‌کند با چه سرعتی لیزر می‌تواند در جهت دیگر جارو شود، یعنی در یک حرکت عمودی. اینها با هم، تعادلی بین وضوح زمانی میکروسکوپ و اندازه قاب مشاهده ایجاد می کنند.
با کار بر روی این مشکل، یک تیم بین‌المللی از محققان چینی و آلمانی اخیراً یک راه‌اندازی قدرتمند TPM با فرکانس اسکن خط بی‌سابقه بالا ایجاد کرده‌اند. بر اساس گزارش آنها منتشر شده در نوروفوتونیکاین سیستم میکروسکوپی برای تصویربرداری از فرآیندهای بیولوژیکی سریع با وضوح زمانی و مکانی بالا طراحی شده است.
یکی از عوامل کلیدی که TPM پیشنهادی را از نمونه‌های معمولی متمایز می‌کند، استفاده از منحرف کننده‌های آکوستو-اپتیک (AODs) برای کنترل اسکن لیزر تحریک است. AOD نوع خاصی از کریستال است که ضریب شکست آن به طور دقیق توسط امواج صوتی قابل کنترل است. این به نوبه خود به ما این امکان را می دهد که پرتو لیزر را به دلخواه از طریق آن هدایت کنیم. مهمتر از آن، AOD ها هدایت لیزری سریع تری را نسبت به گالوانومترهای مورد استفاده در TPM های معمولی امکان پذیر می کنند.
بر این اساس، تیم یک AOD سفارشی با سرعت صوتی فوق العاده بالا با استفاده از دی اکسید تلوریوم (TeO) طراحی کرد.2) کریستال، دستیابی به فرکانس اسکن خط بالا. با استفاده از این AOD، لیزر می تواند یک خط را در قاب تنها در مدت 2.5 میکروثانیه اسکن کند، که مربوط به حداکثر فرکانس اسکن خط 400 کیلوهرتز است. به طور مشابه، تیم از AOD برای دستیابی به فرکانس اسکن آهسته معقول در جهت دیگر استفاده کرد.
برای بهبود بیشتر سازگاری میکروسکوپ خود، این تیم گزینه تغییر مکانیسم اسکن لیزری مبتنی بر گالوانومتر را در صورت لزوم اضافه کردند. این امکان اسکن مناطق بزرگ نمونه را با وضوح و سرعت قابل قبولی فراهم می‌کند و مکان‌یابی مناطق کوچک مورد علاقه را قبل از تغییر به اسکن AOD آسان‌تر می‌کند.
این تیم چندین آزمایش اثبات مفهوم را با TPM جدید طراحی شده انجام داد. آنها پنجره های جمجمه ای را روی موش های دستکاری شده ژنتیکی نصب کردند و از آنها برای مشاهده مورفولوژی و فعالیت نورون ها و همچنین حرکت تک گلبول های قرمز خون (RBCs) استفاده کردند. این سیستم با استفاده از پیکربندی AOD مناسب و اندازه فریم به نرخ فریم تا 10000 FPS دست یافت. این برای اندازه گیری دقیق سرعت انتشار کلسیم در دندریت های عصبی و همچنین برای تجسم مسیر گلبول های قرمز منفرد در داخل رگ های خونی کافی بود.
تحت تأثیر این نتایج، دکتر نا جی، دستیار سردبیر نوروفوتونیک و کرسی یادبود لوئیس آلوارز در فیزیک تجربی در دانشگاه کالیفرنیا برکلی، اظهارات، “سیستم جدید برای میکروسکوپ اسکن مبتنی بر AOD نشان دهنده بهبود قابل توجهی در سرعت و عملکرد تصویربرداری است، همانطور که در کاربرد آن برای انتشار سیگنال کلسیم و اندازه گیری جریان خون در مغز در داخل بدن نشان داده شده است.“
در آینده، طرح جدید اثبات مفهوم TPM ثبت فرآیندهای بیولوژیکی سریع را ممکن می‌سازد و می‌تواند درک ما از آنها را به میزان قابل توجهی بهبود بخشد.
منبع:
SPIE–انجمن بین المللی اپتیک و فوتونیک
مرجع مجله:
لی، آر.، و همکاران (2023). تصویربرداری میکروسکوپ دو فوتونی ده کیلوهرتز از فعالیت دندریتیک تک سلولی و همودینامیک در داخل بدن. نوروفوتونیک. doi.org/10.1117/1.nph.10.2.025006.