تکنیک جدید نقشه هایی با بالاترین وضوح از ژنوم سه بعدی تولید می کند

بخش عمده ای از ژنوم انسان از نواحی تنظیمی تشکیل شده است که کنترل می کنند کدام ژن در یک زمان معین در یک سلول بیان می شود. این عناصر تنظیمی می توانند در نزدیکی یک ژن هدف یا تا 2 میلیون جفت باز دورتر از هدف قرار گیرند.

برای فعال کردن این فعل و انفعالات، ژنوم خود را در یک ساختار سه بعدی حلقه می کند که مناطق دوردست را به هم نزدیک می کند. با استفاده از یک تکنیک جدید، محققان MIT نشان داده اند که می توانند این تعاملات را با وضوح 100 برابر بالاتر از آنچه قبلا ممکن بود ترسیم کنند.

با استفاده از این روش، ما نقشه هایی با بالاترین وضوح از ژنوم سه بعدی که تا کنون تولید شده است را تولید می کنیم و آنچه می بینیم تعاملات زیادی بین تقویت کننده ها و پروموترهایی است که قبلاً دیده نشده اند. ما هیجان زده هستیم که بتوانیم لایه جدیدی از ساختار سه بعدی را با وضوح بالای خود آشکار کنیم.”

اندرس سجر هانسن، استادیار توسعه شغلی آندروود-پرسکات در مهندسی بیولوژیک در MIT و نویسنده ارشد این مطالعه

یافته‌های محققان نشان می‌دهد که بسیاری از ژن‌ها با ده‌ها عنصر تنظیم‌کننده مختلف تعامل دارند، اگرچه مطالعات بیشتری برای تعیین اینکه کدام یک از این برهمکنش‌ها برای تنظیم یک ژن خاص مهم‌تر هستند، مورد نیاز است.

ویرات گوئل، دانشجوی فارغ التحصیل MIT و یکی از محققان می گوید: «محققان اکنون می توانند تعاملات بین ژن ها و تنظیم کننده های آن ها را به صورت مقرون به صرفه مطالعه کنند و دنیایی از امکانات را نه تنها برای ما، بلکه برای ده ها آزمایشگاهی که قبلاً به روش ما ابراز علاقه کرده اند، باز کند. نویسندگان اصلی مقاله ما هیجان زده هستیم که ابزاری را برای جامعه تحقیقاتی به ارمغان بیاوریم که به آنها کمک کند مکانیسم های تنظیم کننده ژن را از هم جدا کنند.”

مایلز حسین، فوق دکترای MIT نیز نویسنده اصلی این مقاله است که امروز در این مقاله منتشر می شود ژنتیک طبیعت.

نقشه برداری با وضوح بالا

دانشمندان تخمین می زنند که بیش از نیمی از ژنوم متشکل از عناصر تنظیم کننده ای است که ژن ها را کنترل می کنند که تنها حدود 2 درصد از ژنوم را تشکیل می دهند. مطالعات ارتباط گسترده ژنوم، که انواع ژنتیکی را با بیماری های خاص مرتبط می کند، انواع مختلفی را که در این مناطق تنظیمی ظاهر می شوند، شناسایی کرده اند. تعیین اینکه این عناصر تنظیمی با کدام ژن‌ها تعامل دارند، می‌تواند به محققان در درک چگونگی ایجاد این بیماری‌ها و به طور بالقوه نحوه درمان آنها کمک کند.

کشف این فعل و انفعالات مستلزم نقشه برداری این است که کدام بخش از ژنوم با یکدیگر تعامل می کنند وقتی کروموزوم ها در هسته قرار می گیرند. کروموزوم ها در واحدهای ساختاری به نام نوکلئوزوم سازماندهی می شوند. رشته های DNA به طور محکم در اطراف پروتئین ها پیچیده شده اند – کمک به قرار گرفتن کروموزوم ها در محدوده کوچک هسته.

بیش از یک دهه پیش، تیمی متشکل از محققان MIT روشی به نام Hi-C را توسعه دادند که نشان داد ژنوم به عنوان یک “گلبول فراکتال” سازماندهی شده است که به سلول اجازه می دهد تا DNA خود را محکم بسته بندی کند و در عین حال از گره ها جلوگیری کند. این معماری همچنین به DNA اجازه می دهد تا در صورت نیاز به راحتی باز شود و تا شود.

برای انجام Hi-C، محققان از آنزیم‌های محدودکننده استفاده می‌کنند تا ژنوم را به قطعات کوچک زیادی برش دهند و قطعاتی را که در نزدیکی یکدیگر در فضای سه‌بعدی درون هسته سلول قرار دارند، به‌صورت بیوشیمیایی پیوند دهند. سپس آنها هویت قطعات در حال تعامل را با تقویت و توالی آنها تعیین می کنند.

در حالی که Hi-C اطلاعات زیادی در مورد سازماندهی کلی سه بعدی ژنوم نشان می دهد، وضوح محدودی برای انتخاب تعاملات خاص بین ژن ها و عناصر تنظیم کننده مانند تقویت کننده ها دارد. تقویت‌کننده‌ها توالی‌های کوتاهی از DNA هستند که می‌توانند به فعال کردن رونویسی یک ژن با اتصال به پروموتر ژن کمک کنند. سایتی که رونویسی شروع می شود.

برای دستیابی به وضوح لازم برای یافتن این تعاملات، تیم MIT بر اساس فناوری جدیدتری به نام Micro-C ساخته شد که توسط محققان دانشکده پزشکی دانشگاه ماساچوست به رهبری استانلی هسیه و الیور راندو اختراع شد. Micro-C برای اولین بار در سال 2015 در مخمرهای جوانه زده استفاده شد و متعاقباً توسط محققانی از جمله Hansen، Hsieh، Rando و دیگران در دانشگاه کالیفرنیا در برکلی و دانشکده پزشکی UMass در سه مقاله در سال‌های 2019 و 2020 در سلول‌های پستانداران استفاده شد.

Micro-C با استفاده از آنزیمی به نام میکروکوکال نوکلئاز برای خرد کردن ژنوم به وضوح بالاتری نسبت به Hi-C می‌رسد. آنزیم های محدود کننده Hi-C ژنوم را تنها در توالی های DNA خاصی که به طور تصادفی توزیع شده اند، برش می دهند و در نتیجه قطعات DNA با اندازه های متفاوت و بزرگتر ایجاد می شود. در مقابل، نوکلئاز میکروکوکی به طور یکنواخت ژنوم را به قطعاتی به اندازه نوکلئوزومی برش می دهد که هر کدام شامل 150 تا 200 جفت باز DNA است. این یکنواختی قطعات کوچک به Micro-C وضوح بالاتری نسبت به Hi-C می دهد.

با این حال، از آنجایی که Micro-C کل ژنوم را بررسی می کند، این رویکرد هنوز به وضوح به اندازه کافی بالا برای شناسایی انواع تعاملاتی که محققان می خواستند ببینند، به دست نمی آورد. به عنوان مثال، اگر می خواهید به نحوه تعامل 100 مکان ژنومی مختلف با یکدیگر نگاه کنید، باید حداقل 100 را در 100 ضرب در 10000 ترتیب دهید. ژنوم انسان بسیار بزرگ است و دارای حدود 22 میلیون مکان با وضوح نوکلئوزوم است. بنابراین، نقشه برداری Micro-C از کل ژنوم انسان به حداقل ۲۲ میلیون ضرب در ۲۲ میلیون خواندن توالی نیاز دارد که بیش از ۱ میلیارد دلار هزینه دارد.

برای کاهش این هزینه، این تیم راهی برای انجام توالی هدفمندتر از فعل و انفعالات ژنوم ابداع کردند که به آنها اجازه می دهد بر بخش هایی از ژنوم که حاوی ژن های مورد علاقه هستند تمرکز کنند. با تمرکز بر مناطقی که چند میلیون جفت پایه را در بر می گیرند، تعداد مکان های ژنومی احتمالی هزار برابر کاهش می یابد و هزینه های توالی یابی یک میلیون برابر کاهش می یابد و به حدود 1000 دلار می رسد. روش جدید که Region Capture Micro-C (RCMC) نامیده می‌شود، بنابراین می‌تواند نقشه‌هایی را با هزینه‌ای 100 برابر غنی‌تر از سایر تکنیک‌های منتشر شده برای کسری از هزینه تولید کند.

هانسن می گوید: “اکنون ما روشی برای تهیه نقشه های ساختار ژنوم سه بعدی با وضوح فوق العاده بالا به روشی بسیار مقرون به صرفه داریم. قبلاً از نظر مالی بسیار غیرقابل دسترس بود زیرا برای بدست آوردن وضوح بالا به میلیون ها، اگر نه میلیاردها دلار نیاز داشتید.” . یک محدودیت این است که شما نمی توانید کل ژنوم را بدست آورید، بنابراین باید بدانید تقریباً به چه منطقه ای علاقه دارید، اما می توانید وضوح بسیار بالا و بسیار مقرون به صرفه داشته باشید.

تعاملات زیاد

در این مطالعه، محققان بر روی پنج منطقه با اندازه‌های متفاوت از صدها هزار تا حدود 2 میلیون جفت پایه تمرکز کردند که به دلیل ویژگی‌های جالبی که توسط مطالعات قبلی آشکار شده بود، انتخاب کردند. اینها شامل یک ژن با مشخصه به نام Sox2 است که نقش کلیدی در تشکیل بافت در طول رشد جنین ایفا می کند.

پس از گرفتن و توالی‌یابی بخش‌های DNA مورد نظر، محققان تقویت‌کننده‌های زیادی را یافتند که با Sox2 برهمکنش می‌کنند، و همچنین برهم‌کنش‌هایی بین ژن‌های مجاور و تقویت‌کننده‌هایی که قبلا دیده نشده بودند، یافتند. در مناطق دیگر، به‌ویژه مناطقی که مملو از ژن‌ها و تقویت‌کننده‌ها بودند، برخی از ژن‌ها با 50 بخش DNA دیگر برهم‌کنش داشتند و به‌طور میانگین هر مکان متقابل با 25 بخش دیگر ارتباط داشت.

حسین می‌گوید: «مردم قبلاً چندین برهمکنش را از یک بیت DNA دیده‌اند، اما معمولاً در حد دو یا سه است، بنابراین دیدن این تعداد زیادی از آنها از نظر تفاوت بسیار مهم بود.

با این حال، تکنیک محققان نشان نمی دهد که آیا همه آن تعاملات به طور همزمان یا در زمان های مختلف رخ می دهد یا اینکه کدام یک از آن تعاملات مهم ترین هستند.

محققان همچنین دریافتند که به نظر می‌رسد DNA خود را به «ریز محفظه‌های» تودرتو می‌پیچد که این تعاملات را تسهیل می‌کند، اما آنها قادر به تعیین چگونگی تشکیل ریزمحفظه‌ها نبودند. محققان امیدوارند که مطالعه بیشتر در مورد مکانیسم های اساسی بتواند این سوال اساسی را در مورد چگونگی تنظیم ژن ها روشن کند.

گوئل می‌گوید: «اگرچه در حال حاضر نمی‌دانیم چه چیزی ممکن است باعث ایجاد این ریزمحفظه‌ها شود، و همه این سؤالات باز را پیش روی خود داریم، حداقل ابزاری برای پرسیدن واقعاً دقیق این سؤالات داریم.

علاوه بر پیگیری این سؤالات، تیم MIT همچنین قصد دارد با محققان بیمارستان کودکان بوستون همکاری کند تا این نوع تجزیه و تحلیل را در مناطق ژنومی که در مطالعات انجمن گسترده ژنوم با اختلالات خونی مرتبط هستند، اعمال کنند. آنها همچنین با محققان دانشکده پزشکی هاروارد برای مطالعه انواع مرتبط با اختلالات متابولیک همکاری می کنند.

این تحقیق توسط کمک مالی مؤسسه Koch پشتیبانی (هسته) از مؤسسه ملی سرطان، مؤسسه ملی بهداشت، بنیاد ملی علوم، جایزه کمیته حمایت از تحقیقات Solomon Buchsbaum، صندوق تحقیقات مرزی مؤسسه Koch، فلوشیپ NIH و بورسیه EMBO.