ناقل های ویروسی مصنوعی ساخته شده از باکتریوفاژ T4 نویدبخش انتقال ژن پیشرفته هستند.

در مطالعه اخیر منتشر شده در مجله ارتباطات طبیعتمحققان روشی را برای ساخت ناقل های ویروسی مصنوعی (AVVs) با استفاده از اجزای ساختاری موجود در باکتریوفاژ T4 ارائه می کنند.

مطالعه: طراحی وکتورهای ویروسی مصنوعی مبتنی بر باکتریوفاژ T4 برای بازسازی ژنوم انسان اعتبار تصویر: Kjpargeter / Shutterstock.com

ناقلان ویروسی چیست؟

AAV ها و لنتی ویروس ها (LVs) برای انتقال اسید دئوکسی ریبونوکلئیک درمانی (DNA) و اسید ریبونوکلئیک (RNA) اصلاح شده اند. با این حال، حامل های ویروسی با محدودیت های خاصی همراه هستند. برای مثال، تحویل ژن‌های درمانی محدود است و گنجاندن سایر مولکول‌های درمانی ضروری برای تعمیرات پیچیده چالش برانگیز است.

T4 یک ویروس بسیار کارآمد با نرخ آلودگی تقریباً 100٪ و چرخه تکثیر سریع تقریباً 20-30 دقیقه در چرخه است. این ویژگی ها نشان می دهد که T4 یک پایه عالی برای ساخت AVV است.

مونتاژ ناقل های ویروسی مصنوعی T4

ساختار ویروسی شبیه به T4-AVVs با مونتاژ بیومواد خالص شده به روشی متوالی ایجاد شد. یک موتور بسته بندی پنتامری بر روی راس پورتال یک پوسته کپسید خالی ساخته شد که از آن خالص شده بود. E. coli آلوده به جهش یافته فاژ T4. این با افزودن پروتئین موتور gp17 به مخلوط واکنش به دست آمد.

DNA خارجی از طریق افزودن DNA پلاسمید خطی شده و آدنوزین تری فسفات (ATP) به داخل کپسید وارد واکنش مونتاژ می شود. موتور بسته بندی T4 با گرفتن و انتقال باکتریوفاژ از یک سر به سر دیگر، DNA را به یک کپسید به روشی پردازشی حرکت می دهد. بسته بندی متوالی مولکول های DNA می تواند چندین بار اتفاق بیفتد و در نتیجه منجر به پر شدن سر شود.

RNA، پروتئین‌ها و کمپلکس‌های آن‌ها از طریق برهمکنش‌های پروتئینی کپسید بیرونی بسیار آنتی ژنیک (Hoc) و کپسید بیرونی کوچک (Soc) به ذرات سر بسته‌بندی شده متصل می‌شوند.

محققان همچنین ذرات را با مولکول‌های لیپید کاتیونی پوشانده‌اند، زیرا آنها فرض می‌کنند که لیپیدهای کاتیونی به دلیل چگالی بالای بارهای منفی در کپسید T4 به‌طور خود به خود از طریق برهمکنش‌های الکترواستاتیکی روی کپسید T4 جمع می‌شوند. نانوذرات T4-AVV ساختاری مشابه ویروس‌های با پوشش طبیعی دارند، از جمله پوسته کپسید، پوشش لیپیدی و «ژنوم» بسته‌بندی شده.

T4-AVV های پوشش داده شده با لیپید در انتقال محموله های ژنتیکی به سلول های انسانی بسیار موثر هستند. علاوه بر این، هنگامی که با پلاسمیدهای خطی متمایز بسته بندی شدند، این AVV ها به طور موثر پلاسمیدهای گزارشگر را به سلول های HEK293T تبدیل کردند.

به طور متوسط، هر نانوذره حاوی تقریباً پنج مولکول پلاسمید لوسیفراز (Luci) و پلاسمید گزارشگر پروتئین فلورسنت سبز (GFP) بود. فلورسانس GFP برای تعیین راندمان انتقال استفاده شد که حدود 100٪ بود.

انتقال T4-AVV با AAV2 که معمولاً مورد استفاده قرار می‌گیرد، مقایسه شد، که هر دوی آنها حاوی توالی پلاسمید یکسانی بودند. با این حال، T4-AVVs چهار تا 19 برابر بیشتر از AAV2 بیان لوسیفراز داشتند، که می‌توان آن را به توانایی T4 در بسته‌بندی حدود هشت مولکول پلاسمید Luci در هر سر نسبت داد، در نتیجه امکان تحویل چندین نسخه از محموله ژنتیکی را فراهم می‌کند. انتقال تک در مقابل، AAV2 محدود به ارائه یک نسخه در یک زمان است.

T4-AVV به دلیل ظرفیت بالای هد که می تواند تا 171 کیلوبیت بر ثانیه را نگه دارد منحصر به فرد هستند. این امکان تحویل ژن‌های درمانی بزرگ، از جمله DNA رمزگذار تمام‌قد ژن دیستروفین انسانی 11 Kbp را فراهم می‌کند، که توسط ناقل‌های LV و AAV فعلی قابل دستیابی نیست.

AVVهای ویرایش ژنوم

AVV های ویرایش ژنوم مختلف با ترکیب همه مولکول های ویرایش در یک AVV واحد در آرایش های مختلف ایجاد شدند. اولین مجموعه از AVVها حاوی پلاسمیدهایی با ژن‌های Cas9 و gRNA قابل بیان بود که در آن‌ها انتهای Cas9 N با توالی محلی‌سازی هسته‌ای (NLS) PKKKRKV71 ترکیب شد و برای ایجاد NLS-Cas9 با کدون بهینه‌سازی شد. پس از آن، Cas9 برای انجام ویرایش ژنوم به هسته منتقل شد، در حالی که gRNA به سمت مکان بندر امن AAVS1 یا مکان PPP1R12C روی کروموزوم 19 از ژنوم انسان هدایت شد.

T4-AVVs برای هدف قرار دادن ژن بتا هموگلوبین (HBB) در کروموزوم 11 ژنوم انسان برای انجام ویرایش ژنوم در یک مکان مهم از نظر درمانی استفاده شد. AVV های مونتاژ شده با کمپلکس های ریبونوکلئوپروتئین (RNP) gRNA Cas9-HBB (AVV4) تقریباً 20-25٪ ویرایش را در سایت مورد نظر به دست آوردند.

علاوه بر این، AVV ها با نمایش دو کمپلکس gRNA-RNP بر روی یک AVV منفرد (AVV5) ایجاد شدند که یک مجموعه در سایت HBB و دیگری در سایت AAVS1 قرار داشت. AVVهای Multiplex با موفقیت ژنوم را در دو سایت کروموزوم مختلف ویرایش کردند، تقریباً 20٪ در سایت HBB و تقریبا 30٪ در سایت AAVS1.

نتیجه گیری

محققان دسته جدیدی از نانومواد به نام پلت فرم ویروسی مصنوعی مبتنی بر باکتریوفاژ را توسعه دادند که می تواند در یک لوله آزمایش از طریق یک رویکرد خط مونتاژ تولید شود. AVV ها ساختاری شبیه به ویروس های طبیعی دارند. با این حال، تحقیقات بیشتری برای درک نحوه ورود آنها به سلول ها، فرار از اندوزوم ها، جداسازی و حرکت در سلول ها برای بهبود تحویل آنها مورد نیاز است.

این پلتفرم جدید برای استفاده درمانی آماده است و می‌تواند نقایص سلول‌های اولیه انسان را در داخل و خارج از بدن اصلاح کند. توسعه فناوری‌های نانوذرات لیپیدی و استفاده از تکنیک‌های مهندسی تکرارهای کوتاه پالیندرومیک (CRISPR) سنتی و خوشه‌ای برای ایجاد طرح‌های محموله خاص ضروری است.

قابل ذکر است، برخی از نگرانی‌های ایمنی ممکن است در طول انتقال T4-AVVs به کلینیک، از جمله واکنش‌های ناخواسته احتمالی توسط سیستم ایمنی میزبان یا تأثیرات خارج از هدف ایجاد شوند. بنابراین، پلت فرم T4-AVV در حال حاضر برای ایمنی و کارایی آن در حال بررسی است.