روش جدید می تواند فعالیت کامل پروتئین ها را در سلول های زنده ردیابی کند

برنامه‌های ژنتیکی درون DNA ما از طریق پروتئین‌ها، که زیربنای ساختار و فعالیت بدن ما هستند، به ثمر می‌رسند. با این حال، پروتئوم – تمام پروتئین های موجود در یک سلول یا ناحیه مشخص – نسبتاً مرموز باقی می ماند زیرا مناظر پروتئینی فوق العاده پیچیده هستند. برای مثال انسان ها ده ها هزار پروتئین مختلف می سازند.

برای کمک به رمزگشایی این پیچیدگی، تیمی از محققان دانشگاه استنفورد توسعه روش جدیدی به نام TransitID را برای ردیابی فعالیت کامل پروتئین ها در سلول های زنده هدایت کرده اند. این روش در مقاله ای که در 28 ژوئن منتشر شده است به تفصیل آمده است سلول.

تکنیک‌های موجود برای این کار، میکروسکوپ، و پروتئومیکس طیف‌سنجی جرمی، یا به دانشمندان اجازه می‌دهد که تنها تعداد انگشت شماری از پروتئین‌ها را در یک سلول زنده مطالعه کنند، یا تصویری بسیار دقیق، اما همچنان، از تمام پروتئین‌های یک سلول مرده ارائه دهند.

تکنیک جدید ما به شما این امکان را می‌دهد که با نگاه واقعی به نمونه‌های زنده – از جمله دینامیک آنها در حین حرکت و عملکرد – و مشاهده بی‌طرفانه همه پروتئین‌ها در یک زمان، نقاط قوت پروتئومیک میکروسکوپی و طیف‌سنجی جرمی را ترکیب کنید. قبلاً هیچ روشی وجود نداشت که این نقاط قوت را ترکیب کند.”

آلیس تینگ، استاد ژنتیک در پزشکی استنفورد و زیست شناسی در دانشکده علوم و علوم انسانی، نویسنده ارشد مقاله

TransitID روی پروتئین هایی که بین سلول ها حرکت می کنند نیز کار می کند. ردیابی پروتئین ها در این سطح از جزئیات و سرزندگی می تواند اطلاعات ناگفته ای را در مورد نحوه ارتباط سلول ها آشکار کند. علاوه بر این، کاربردهای آشکاری برای تحقیق در مورد بیماری ها و درمان های مختلف، از جمله در حوزه سرطان و بیماری های عصبی وجود دارد.

جولین چی، کاندیدای دکترا در استنفورد و یکی از نویسندگان مقاله، می‌گوید: «این هیجان‌انگیز است که کاربردهای گسترده‌ای برای این کار وجود دارد. ما قبلاً سؤالات زیادی در مورد TransitID دریافت کرده‌ایم و همکاری‌های زیادی با آزمایشگاه‌های دیگری که علاقه‌مند به استفاده از آن هستند، ایجاد کرده‌ایم.»

ردیابی یک سفر جمعی

به عبارت بسیار ساده، TransitID تمام پروتئین‌ها را در طول یک سفر خاص با برچسب‌گذاری تمام مولکول‌ها در شعاع مشخصی از مکان‌های انتخابی آغاز و پایان ردیابی می‌کند. ابتدا، دو آنزیم که قبلاً توسط آزمایشگاه Ting ساخته شده بود، به نام‌های TurboID و APEX، در هر انتهای سفر قرار می‌گیرند. هنگامی که محققان آماده شروع نظارت بر پروتئین خود هستند، بیوتین ویتامین B را معرفی می کنند که باعث می شود TurboID بیوتین را روی تمام مولکول های اطراف – از جمله پروتئین ها – که آنها را برچسب گذاری می کند اسپری کند. سپس محققان سلول را از بیوتین اضافی شسته و به آن اجازه می دهند تا فعالیت معمول خود را انجام دهد. هنگامی که آنها فکر می کنند پروتئین ها زمان کافی برای سفر داشته اند، سپس ترکیب شیمیایی آلکین فنل را اضافه می کنند که باعث همان عمل پاشش در انتهای APEX می شود.

محققان سفرهای فردی پروتئین هایی را که بین مکان های برچسب گذاری شده حرکت می کردند، با شکستن غشای سلولی و تجزیه و تحلیل محتویات تفسیر می کنند. برخی از پروتئین ها هرگز حرکت نخواهند کرد، چه فقط دارای برچسب های TurboID یا فقط برچسب های APEX هستند. آنهایی که هر دو را دارند، سفر بین آنها را انجام دادند. و هر چیزی بدون برچسب فراتر از سفر مورد علاقه بود.

چهار آزمایش، یک شگفتی

به منظور آزمایش ابزار خود، محققان ابتدا دو آزمایش را انجام دادند که جزئیات فعالیت پروتئین شناخته شده را شرح می داد. آن‌ها پروتئین‌هایی را که بین مایع سیتوپلاسم (سیتوزول) به سمت میتوکندری حرکت می‌کردند، کنترل کردند، پروتئین‌هایی که برخلاف پروتئین‌هایی که محصول DNA میتوکندری هستند و بنابراین از میتوکندری منشأ می‌گیرند، وجود دارند. در آزمایش بعدی، محققان چگونگی تغییر حرکت پروتئین از سیتوزول به هسته را هنگامی که یک سلول تحت استرس اکسیداتیو قرار می‌گیرد، پیگیری کردند. نتایج هر دوی این آزمایش‌ها همان‌طور که انتظار می‌رفت به دست آمد، که به این معنی بود که TransitID با موفقیت کار می‌کرد.

در مرحله بعد، محققان از تکنیک خود برای بررسی ترافیک پروتئین به بخش‌هایی از سلول که توسط غشاها محدود نشده‌اند استفاده کردند – به‌ویژه، گرانول‌های استرس، که تراکم پروتئین‌ها و RNA‌هایی هستند که در پاسخ به استرس سلولی تشکیل می‌شوند.

جی پل تیلور، مدیر علمی و معاون اجرایی، می گوید: “میعانات زیست مولکولی، مانند گرانول های استرس، ساختارهای بسیار دینامیکی هستند که به سرعت و به طور مداوم اجزای تشکیل دهنده را با ساختارهای مرتبط مبادله می کنند. TransitID برای اولین بار به ما اجازه می دهد تا سرنوشت این اجزا را دنبال کنیم.” رئیس بیمارستان تحقیقاتی کودکان سنت جود، که یکی از نویسندگان مقاله است.

نتایج این آزمایش شگفت آور بود. همانطور که محققان در حال تجزیه و تحلیل پروتئوم گرانول های استرس بودند، به JUN، یک فاکتور رونویسی معروف که در سرطان های متعدد تنظیم یا بیش از حد بیان می شود، یافتند.

تینگ می گوید: «هیچ کس تا به حال آن را در دانه های استرس پیدا نکرده است. بنابراین، وقتی آن را در آنجا پیدا کردیم، تقریباً به آن اعتماد نکردیم.»

پس از تایید حضور آن، محققان بیشتر بررسی کردند و به این نتیجه رسیدند که به نظر می‌رسد JUN به عنوان مکانیزم حفاظتی در گرانول استرس قرار دارد. آنها دریافتند که تحت استرس اکسیداتیو، JUN به گرانول استرس تغییر مکان می دهد تا از پاسخ استرس جایگزین خود جلوگیری کند – تجمع و سپس به دلیل یک آشفتگی تجمع ناخواسته دور انداخته شود – که JUN را سالم نگه می دارد و پس از پایان استرس در دسترس است تا کار خود را از سر بگیرد.

آخرین آزمایش با TransitID موجود در این مقاله، فعالیت پروتئین را بین ماکروفاژها و سلول‌های سرطانی، که در یک محیط پروتئینی پیچیده و پر سر و صدا وجود دارد، ردیابی کرد.

بهبود در پتانسیل عالی

با وجود هزاران درخواست برای TurboID و APEX که قبلاً از آزمایشگاه‌های سراسر جهان در پاسخ به کارهای قبلی دریافت شده‌اند، محققان می‌دانند که برداشت جدید آنها از این موارد مورد علاقه موجود، نتایج هیجان‌انگیز را هم در علوم پایه و هم در علوم کاربردی ممکن می‌سازد.

تیلور گفت: “من انتظار دارم که این رویکرد به سرعت توسط طیف گسترده ای از دانشمندان، مشابه سایر تکنیک های نوآورانه توسعه یافته در آزمایشگاه آلیس، اتخاذ شود.” “این ابزار پیشرفت مهمی است که امکان بررسی میعانات را فراهم می کند زیرا آنها ساختارهای بسیار پویا هستند.”

تینگ می‌گوید: «من از سادگی روش و میزان دسترسی به آن، با توجه به آنچه در حال حاضر وجود دارد، هیجان‌زده هستم. این روش از معرف‌های تجاری موجود استفاده می‌کند و افراد برای استفاده از این روش نیازی به انجام هیچ گونه شیمی آلی در آزمایشگاه‌های خود ندارند، و با این حال می‌توانند به زیست‌شناسی کاملاً جدیدی دسترسی داشته باشند که قبلاً قابل مشاهده نبود.»

این تیم هنوز جای پیشرفت را می بیند، به ویژه با هدف بهینه سازی فرآیند خود و تکیه بر مواد شیمیایی کمتر سمی. در حال حاضر، TransitID محدود به استفاده در کشت سلولی است، اما، با مواد شیمیایی ملایم تر، می توان از آن برای ردیابی دینامیک دقیق پروتئین در حیوانات زنده استفاده کرد.