دانشمندان فرآیندهای نانومقیاس مجتمع های CRISPR-Cas را دنبال می کنند

هنگامی که باکتری ها توسط یک ویروس مورد حمله قرار می گیرند، می توانند با مکانیسمی از خود دفاع کنند که مواد ژنتیکی معرفی شده توسط مهاجم را دفع می کند. کلید کمپلکس های پروتئینی CRISPR-Cas است. تنها در دهه گذشته است که عملکرد آنها برای ایمنی تطبیقی ​​در میکروارگانیسم ها کشف و روشن شده است. با کمک یک RNA جاسازی شده، کمپلکس های CRISPR یک توالی کوتاه را در DNA مهاجم تشخیص می دهند. مکانیسم تشخیص توالی توسط RNA از آن زمان برای خاموش کردن انتخابی و اصلاح ژن ها در هر موجود زنده استفاده شده است. این کشف مهندسی ژنتیک را متحول کرد و قبلاً در سال 2020 با جایزه نوبل شیمی که به امانوئل شارپنتیه و جنیفر آ. دودنا اعطا شده بود، مفتخر شد.

با این حال، گاهی اوقات، کمپلکس های CRISPR به بخش های ژنی که کمی با توالی مشخص شده توسط RNA متفاوت است، واکنش نشان می دهند. این منجر به عوارض جانبی نامطلوب در کاربردهای پزشکی می شود. دومینیک کائورت، که به عنوان دانشجوی دکترا روی این پروژه کار می کرد، می گوید: «دلایل این امر هنوز به خوبی شناخته نشده است، زیرا تا کنون نمی توان این فرآیند را مستقیماً مشاهده کرد.

فرآیندهای نانومقیاس با جزئیات ردیابی شدند

برای درک بهتر فرآیند تشخیص، تیمی به رهبری پروفسور رالف سیدل و دومینیک کائورت از این واقعیت استفاده کردند که مارپیچ دوگانه DNA توالی هدف در حین تشخیص باز می شود تا جفت شدن باز با RNA را امکان پذیر کند. کائورت می‌گوید: «بنابراین سؤال اصلی این پروژه این بود که آیا باز کردن یک قطعه DNA که تنها 10 نانومتر طول دارد، می‌تواند در زمان واقعی ردیابی شود یا خیر».

برای مشاهده جزئیات فرآیند باز شدن، دانشمندان مجبور شدند آن را با میکروسکوپ قابل مشاهده کنند. برای دستیابی به این هدف، تیم از دستاوردهای نانوتکنولوژی DNA استفاده کرد که می تواند برای ایجاد هر نانوساختار DNA سه بعدی استفاده شود. با استفاده از این روش به اصطلاح اوریگامی DNA، محققان یک بازوی روتور DNA به طول 75 نانومتر با یک نانوذره طلا که به انتهای آن متصل شده بود، ساختند. در این آزمایش، باز شدن توالی DNA نازک 2 نانومتری و طول 10 نانومتر به چرخش نانوذره طلا در امتداد دایره‌ای با قطر 160 نانومتر منتقل شد – این حرکت را می‌توان با استفاده از یک میکروسکوپ ویژه بزرگ‌نمایی و ردیابی کرد.

با این روش جدید، محققان توانستند تشخیص توالی توسط مجتمع CRISPR Cascade را تقریباً جفت به جفت پایه مشاهده کنند. با کمال تعجب، جفت شدن باز با RNA از نظر انرژی سودمند نیست، به این معنی که این کمپلکس فقط در طول تشخیص توالی به طور ناپایدار محدود می شود. تنها زمانی که کل توالی شناسایی شود، اتصال پایدار رخ می دهد و DNA متعاقبا از بین می رود. اگر توالی هدف “اشتباه” باشد، فرآیند متوقف می شود.

یافته ها به انتخاب توالی های RNA مناسب کمک خواهد کرد

این واقعیت که فرآیند شناسایی گاهی اوقات نتایج نادرستی ایجاد می کند به دلیل ماهیت تصادفی آن است، یعنی به دلیل حرکات مولکولی تصادفی، همانطور که محققان اکنون توانسته اند نشان دهند. Kauert می گوید: «تشخیص توالی توسط نوسانات حرارتی در جفت شدن پایه انجام می شود. با داده‌های به‌دست‌آمده، می‌توان یک مدل ترمودینامیکی از تشخیص توالی ایجاد کرد که تشخیص بخش‌های دنباله انحرافی را توصیف می‌کند. در آینده، این امر باید امکان انتخاب بهتر توالی‌های RNA را فراهم کند که فقط توالی هدف مورد نظر را تشخیص می‌دهند، بنابراین دقت دستکاری ژنتیکی را بهینه می‌کند.

از آنجایی که نانوروتورهای طراحی شده از نظر مناسب بودن برای اندازه‌گیری پیچش و گشتاور در مولکول‌های منفرد، جهانی هستند، می‌توانند برای سایر مجتمع‌ها یا بیومولکول‌های CRISPR-Cas نیز استفاده شوند.

این کار توسط شورای تحقیقات اروپا و بنیاد تحقیقات آلمان تامین مالی شد و با همکاری گروه تحقیقاتی پروفسور ویرجینیوس سیکسنیس از دانشگاه ویلنیوس در لیتوانی، که مجتمع‌های CRISPR مورد استفاده را جداسازی و ارائه کردند، انجام شد.