در مطالعه‌ای که اخیراً در Nature منتشر شده است، محققان عملکرد ضد شدید سندرم تنفسی حاد ویروس کرونا 2 (SARS-CoV-2) فسفولیپید اسکرامبلاز 1 (PLSCR1) را شناسایی کردند، یک عامل محدودکننده خودگردان سلولی ناشی از اینترفرون گاما (IFNγ).
شناسایی آن به افزایش درک ایمنی محافظتی در پاسخ IFN انسان کمک خواهد کرد.
این مطالعه از نمایشگرهای پروتئین 9 مرتبط با پروتئین 9 مرتبط با پروتئین CRISPR و سلول‌های کبدی که آنزیم تبدیل‌کننده آنژیوتانسین 2 (ACE2) را به‌صورت نابجا بیان می‌کنند (ACE2) برای مطالعه عملکرد PLSRS-CoV در برابر زنده استفاده کرد. -2 قبل و بعد از تحریک با IFNγ.
مطالعه: PLSCR1 یک عامل دفاعی خودگردان سلولی در برابر عفونت SARS-CoV-2 است. اعتبار تصویر: AndriiVodolazhskyi/Shutterstock.com
زمینه
در بسیاری از گیاهان، باکتری ها و حیوانات، از جمله انسان، ایمنی سلولی به مبارزه با عفونت های ویروسی و سایر عفونت ها کمک می کند، به عنوان مثال، شیگلا فلکسنر و مایکوباکتریوم توبرکلوزیس. IFNγ، یک سیتوکین نوع II، یک عامل به خوبی شناخته شده برای بسیج ایمنی خودگردان سلولی در اکثر سلول های هسته دار است.
بنابراین، مطالعات نشان داده‌اند که افزایش بیان IFNهای نوع I و III (IFNα\β و IFNλ) باعث محافظت در برابر بیماری کروناویروس ۲۰۱۹ (COVID-19) در بزرگسالان و کودکان می‌شود.
برعکس، ضایعات ژنتیکی در سیگنال دهی IFN و اتوآنتی بادی های نوع I و II IFN مسئول تا 20 درصد موارد بحرانی COVID-19 هستند. سلول‌های T همچنین واکسن‌های COVID-19 و گونه‌های نگران کننده SARS-CoV-2 (VOCs) را با ترشح IFNγ شناسایی می‌کنند.
تا کنون، تمرکز پژوهش استفاده از آنتی بادی های خنثی کننده (nAbs) به عنوان داروهای درمانی COVID-19 بوده است. شواهد اخیر مبنی بر اینکه درمان با IFNγ بیماران نقص ایمنی مبتلا به کووید-19 را که درمان پلاسمای نقاهت یا رمدسیویر برای آنها شکست خورده است، نجات داده است، جامعه تحقیقاتی را بر آن داشت تا بررسی کنند که آیا IFNγ می تواند دفاع ضد SARS-CoV-2 را تنظیم کند یا خیر.
در مورد مطالعه
در مطالعه حاضر، محققان از هپاتوم Huh7.5 انسان و سلول‌های A549-ACE2 (تقلید از اهداف سلول میزبان در دستگاه تنفسی) برای آزمایش قدرت IFNγ در محدود کردن عفونت زنده SARS-CoV-2 استفاده کردند که با استفاده از مهندسی CRISPR-Cas9 تأیید کردند. .
در مرحله بعد، آنها از صفحه نمایش های از دست دادن عملکرد (LoF) در سطح ژنوم استفاده کردند تا مشخص کنند کدام یک از عوامل محدود کننده ناشی از IFNγ این اثر را در برابر SARS-CoV-2 ایجاد می کند.
محققان از یک کتابخانه اسید ریبونوکلئیک (sgRNA) تک راهنمای GeCKO نسخه 2.0 برای انتقال هر نوع سلول استفاده کردند و سپس انتخاب پورومایسین را برای اطمینان از یکپارچگی پایدار انجام دادند. این کتابخانه دارای 122441 sgRNA بود که 19050 ژن را در بر می گرفت.
آنها از SARS-CoV-2 بیانگر mNeonGreen (mNG) برای آلوده کردن سلول های ادغام شده با sgRNA که با IFNγ انسانی نوترکیب تیمار شده بودند، استفاده کردند. سپس، با کمک مرتب‌سازی سلول‌های فعال شده با فلورسانس (FACS)، محققان سلول‌های آلوده به SARS-CoV-2 را به جمعیت‌های mNGhigh و mNGlow جدا کردند، که در آن اولی مجاز بود در حالی که دومی محدودکننده بود. سپس، آنها توالی یابی نسل بعدی فرکانس های sgRNA را انجام دادند.
علاوه بر این، تیم PLSCR1 شناسایی کرد که کدام مرحله از چرخه زندگی SARS-CoV-2 و چگونه از طریق یک مسیر همجوشی اندوزومی وابسته به کاتپسین یا مسیر همجوشی سطح سلولی وابسته به سرین پروتئاز 2 (TMPRSS2) از تهاجم ویروس کرونا جلوگیری می کند.
علاوه بر این، این تیم از یک روش مبتنی بر گزارشگر نانولوک برای آزمایش همجوشی ویروس-اندوزوم در سیتوزول سلول میزبان استفاده کرد. علاوه بر این، آنها تصویربرداری در مقیاس نانو را با جهش‌زایی پروتئین ترکیب کردند تا تعیین‌کننده‌های غشایی مورد نیاز را تشخیص دهند که چگونه PLSCR1 مانع همجوشی SARS-CoV-2 می‌شود.
نتایج و نتیجه گیری
مطالعه حاضر چندین یافته مهم داشت. ابتدا، نویسندگان دریافتند که پس از قرار گرفتن در معرض IFNγ نوع دوم انسانی نوترکیب، سلول‌های Huh7.5 SARS-CoV-2 را در یک مبدل سیگنال و فعال‌کننده به روشی وابسته به رونویسی-1 (STAT1) محدود کردند.
دوم، سویه SARS-CoV-2 اجدادی محدود شده توسط IFNγ، PLSCR1، USA-WA1/2020. با این حال، آن را نیز در برابر Delta و Omicron BA.1 VOCs موثر بود. فعالیت ضد ویروسی آن حتی در برابر سایر کروناویروس‌های بسیار بیماری‌زا، با داشتن خفاش‌ها و موش‌ها به عنوان میزبان، قوی باقی ماند.
سوم، در PLSCR1سلول های حذفی، همجوشی سلول-سلول با واسطه SARS-CoV-2 سنبله (S) به طور قابل توجهی افزایش یافت، در حالی که PLSCR1 بیان بیش از حد این پاسخ را کاهش داد. این مشاهدات تأیید کرد که PLSCR1 مستقیماً از همجوشی غشاء ناشی از پروتئین SARS-CoV-2 S جلوگیری می کند.
به همین ترتیب، در سلول‌های A549-ACE2، کانون‌های غنی‌شده با PLSCR1 در عرض 30 دقیقه پس از عفونت ویروسی ظاهر شدند و ذرات ویروسی کاملاً همپوشانی داشتند که توسط آنتی‌بادی‌های ضد S شناسایی شدند. PLSCR1 علیه ورود SARS-CoV-2 عمل کرد و ورودی ویروسی با واسطه S را هدف قرار داد.
به طور شگفت انگیزی، در جذب SARS-CoV-2 در هر دو مسیر همجوشی درون سلولی و وابسته به TMPRSS2 قبل از انتشار RNA ویروسی در سیتوزول سلول میزبان، یعنی در مرحله ورود دیرهنگام، تداخل داشت. بدین ترتیب، PLSCR1 جهش‌ها می‌توانند افراد را به شدت مستعد ابتلا به COVID-19 شدید کنند، همانطور که در گزارش اخیر تأیید شده است.
مدل‌سازی ساختاری پیش‌بینی کرد که PLSCR1 دارای یک دامنه N ترمینال انعطاف‌پذیر و بشکه β غشایی 12 رشته‌ای است که مارپیچ آبگریز ترمینال C را مدفون می‌کند.
هنگامی که PLSCR1 توسط پالمیتویلاسیون به غشای پلاسمایی هدف متصل شد، از بشکه β-ترمینال C خود برای ایجاد اختلال در ادغام ویروس با سلول میزبان استفاده کرد، که به عنوان محاصره همجوشی شناخته می شود، همانطور که توسط تجزیه و تحلیل شبیه سازی دینامیک مولکولی نانوثانیه (MDS) آشکار شد.
PLSCR1 احتمالاً میکرو دامنه‌های غشای پلاسمایی را اشغال کرده است که توسط کروناویروس‌ها برای هدایت زیرجمعیت‌های متمایز وزیکول‌های SARS-CoV-2 استفاده می‌شوند. با توجه به لنگر palmitoyl خود، آن را بر روی غشاهای با انحنای بالا و کم (غشاء غشای پلاسمایی و اندوزوم) برای مهار همجوشی S-واسطه عمل کرد.
نتیجه
به طور کلی، این مطالعه یک چارچوب مکانیکی برای PLSCR1 در مسدود کردن همجوشی با واسطه SARS-CoV-2-S توسط کروناویروس های بدخیم ارائه کرد.
این بشکه β PLSCR1 را به عنوان یک عامل تعیین کننده ساختاری اصلی ایمنی سلولی خودگردان در برابر خانواده بزرگ کروناویروس برجسته می کند.