کیتDelta hrHPV Real-time PCR جهت انجام یک تست تشخیصی (غربالگری) In vitro کیفی به‌منظور ژنوتایپینگ انواع پرخطر HPV16 وHPV18 و همچنین تشخیص همزمان (Pool) سایر تیپ‌های پرخطر پاپیلوماویروس انسانی (شامل HPV31، HPV33، HPV35، HPV39، HPV45، HPV51، HPV52، HPV56، HPV58، HPV59، HPV66 و HPV68) طراحی شده است. این تست بر روی نوکلئیک اسید استخراج شده از نمونه‌های بالینی بدست آمده از گردنه رحم (سرویکس) انجام میشود. این نمونه‌های بالینی با استفاده از یک سیتوبراش جمع‌آوری شده و در یک محلول نگهدارنده قرار داده می‌شوند و سپس استخراج DNA از این نمونه‌ها انجام میشود. کاربرد تست مذکور، غربالگری زنان بالای 30 سال در معرض خطر سرطان دهانه رحم است و نتایج این تست جهت تصمیم‌گیری در مورد نیاز به انجام کولپوسکوپی و پیگیری‌های بعدی کاربرد دارد. این کیت برای استفاده‌ی پرسنل آموزش دیده آزمایشگاه می‌باشد. اساس تست تشخیصی حاضر، تکنیک Multiplex probe-based real-time PCR است. در این روش، نواحی مختلفی از ژنوم پاپیلوماویروس‌های انسانی پرخطر (ژن‌های E6 و E7) بعنوان هدف تشخیصی در فرآیند PCR تکثیر می‌شوند. برای این منظور، ابتدا DNA ژنومی استخراج شده از هر نمونه‌ی بالینی بعنوان الگو در دو واکنش Real-time PCR مجزا (درون 2 میکروتیوب حاوی HPV mix A و HPV mix B) اضافه میشود تا بعد از تکثیر، بوسیله‌ی پروب‌های متصل به رنگ‌های فلوروسنت (فلوروفور) شناسایی شود. این پروب‌ها در انتهای ´5 دارای فلوروفورهای مختلف و در انتهای ´3 دارای یک خاموش کننده (کوئنچر) هستند. در میکروتیوب حاوی HPV mix Aیکی از پروب‌ها که به فلوروفور FAM متصل است جهت شناسایی HPV16 و سایر پروب‌ها که به فلوروفور HEX متصل هستند جهت شناسایی سایر تیپ‌های پرخطر پاپیلومای انسانی شامل HPV31، HPV39،HPV51، HPV58، HPV59 و HPV68 و همچنین پروب دیگر متصل به فلوروفور Texas red جهت شناسایی ژن کنترل داخلی شماره 1 استفاده می‌شوند. در میکروتیوب حاوی HPV mix Bیکی از پروب‌ها که به فلوروفور FAM متصل است جهت شناسایی ژن کنترل داخلی شماره 2 و سایر پروب‌ها که به فلوروفور HEX متصل هستند جهت شناسایی سایر تیپ‌های پرخطر پاپیلومای انسانی شامل HPV33، HPV35، HPV45، HPV52، HPV56 و HPV66 و همچنین پروب دیگر متصل به فلوروفور Texas red جهت شناسایی HPV18 استفاده می‌شوند. حضور کوئنچر در کنار فلوروفور مانع از ساطع شدن رنگ‌های فلوروسنت میشود. اما حین انجام واکنش PCR در صورت وجود ژنوم هدف، پرایمرها و پروب‌های اختصاصی به نواحی مربوطه متصل می‌شوند و به‌منظور تکثیر ناحیه‌ی هدف، آنزیم پلیمراز به انتهای ´3 پرایمرها متصل شده و شروع به سنتز رشته‌های جدید می‌کند. در حین سنتز رشته‌های جدید، این آنزیم با استفاده از فعالیت اگزونوکلئازی باعث هیدرولیز پروب‌های متصل شده به نواحی هدف مربوطه شده و باعث جدا شدن کوئنچر از فلوروفورها و در نتیجه ساطع شدن رنگ‌های مختلف فلوروسنت می‌شوند که دستگاه Real-time PCR قادر به خوانش و ثبت آن‌ها بصورت یک منحنی سیگموئیدی شکل می‌باشد. در نهایت بعد از پایان واکنش PCR نتایج با استفاده از نرم افزار مربوطه آنالیز می‌شوند و مقادیر Ct (Cq)های مربوط به هر کانال بدست می‌آید
کیت ریل تایم پی سی آر HPV
15,500,000 تومان
کیت غربالگری/ژنوتایپینگ مولکولی تیپ‌های پرخطر پاپیلوماویروس انسانی بر اساس تکنیک ریل تایم PCR
کیت ریل تایم پی سی آر HPV : کیت Delta hrHPV Real-time PCR جهت انجام یک تست تشخیصی (غربالگری) In vitro کیفی به‌منظور ژنوتایپینگ انواع پرخطر HPV16 و HPV18 و همچنین تشخیص همزمان (Pool) سایر تیپ‌های پرخطر پاپیلوماویروس انسانی (شامل HPV31، HPV33، HPV35، HPV39، HPV45، HPV51، HPV52، HPV56، HPV58، HPV59، HPV66 و HPV68) طراحی شده است. این تست بر روی نوکلئیک اسید استخراج شده از نمونه‌های بالینی بدست آمده از گردنه رحم (سرویکس) انجام میشود. این نمونه‌های بالینی با استفاده از یک سیتوبراش جمع‌آوری شده و در یک محلول نگهدارنده قرار داده می‌شوند و سپس استخراج DNA از این نمونه‌ها انجام میشود. کاربرد تست مذکور، غربالگری زنان بالای 30 سال در معرض خطر سرطان دهانه رحم است و نتایج این تست جهت تصمیم‌گیری در مورد نیاز به انجام کولپوسکوپی و پیگیری‌های بعدی کاربرد دارد. اساس تست تشخیصی حاضر، تکنیک Multiplex probe-based real-time PCR است.
مشخصات کیت
|
مقدار |
ریجنت |
|
|
750 میکرولیتر |
HPV mix A |
1 |
|
750 میکرولیتر |
HPV mix B |
2 |
|
100 میکرولیتر |
HPV negative ctrl |
3 |
|
100 میکرولیتر |
HPV positive ctrl |
4 |
قبل از انجام تست تمامی اجزای کیت به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار داده شوند تا به آرامی ذوب شوند. استفاده از کرایورک به منظور نگهداری محلول‌ها در این مرحله پیشنهاد میشود. سپس برای حل کردن و هموژن کردن محلول‌ها از ورتکس استفاده شود. در مرحله بعد، تمامی محلول‌ها اسپین شوند تا در صورتی که قطرات محلول روی درب تیوب‌ها باشد به ته میکروتیوب کشیده شوند.
مراحل:
1– در زیر یک ورک استیشن PCR، به ازای هر نمونه، مقدار 15 میکرولیتر از HPV mix A را در یک چاهک از پلیت مخصوص Real-time PCR (یا هر تیوب از استریپ تیوب 8تایی) و مقدار 15 میکرولیتر از HPV mix B را در یک چاهک دیگر الیکوت نمایید.
2– در زیر یک ورک استیشن دیگر مقدار 5 میکرولیتر از هر DNA استخراج شده‌ی پاپیلوماویروس را در به دو چاهک حاوی HPV mix A و HPV mix B اضافه و سپس اسپین نمایید.
در این مرحله، بطور موازی مقدار 5 میکرولیتر از هر کدام از کنترل‌های مثبت HPV positive ctrl و منفی HPV negative ctrl موجود در کیت را نیز به‌صورت جداگانه به 2 چاهک دیگر حاوی میکس واکنش اضافه نمایید.
3– پلیت یا استریپ حاوی میکس واکنش حاصل از مرحله‌ی قبل را به دستگاه Real-time PCR منتقل کرده و برنامه‌ی آورده شده در جدول روبرو را اجرا نمایید.
* خوانش فلوروسنت در کانال‌های FAM،HEX و Texas red در این مرحله انجام شود و در صورت نیاز Passive reference dye (ROX) در حالت خاموش قرار داده شود.
دستگاه‌های ریل تایم PCR پیشنهادی: Roche LightCycler، BMS Mic-qPCR و Applied Biosystems
|
زمان (ثانیه) |
دما (درجه سانتیگراد) |
مرحله |
سیکل |
|
300 |
95 |
فعال شدن آنزیم پلیمراز |
X 1 |
|
15 |
95 |
باز شدن رشته‌های DNA الگو |
X 40 |
|
15 |
55 |
جفت شدن پرایمرها |
|
|
30 * |
72 |
سنتز رشته های جدید |
|
|
30 |
25 |
خنک شدن |
X 1 |
- بعد از انجام PCR، هر نمونه‌ی بیمار باید بصورت مجزا مورد بررسی و آنالیز قرار گیرد. پیشنهاد میشود جهت بدست آوردن مقادیر دقیقتر Ct، ترشهلد (آستانه) از حالت اتومات خارج شود و خط ترشهلد (Threshold line) بصورت دستی تنظیم شود.
- منحنی‌های مشاهده شده برای هر کدام از کانال‌ها باید بصورت تک تک مورد بررسی قرار گیرند. ممکن است بلند بودن ارتفاع یک منحنی در یک کانال باعث دیده نشدن منحنی کانال دیگر (مخصوصا کانال HEX) شود. با بررسی تک به تک منحنی‌های هر کانال یا تنظیم Scale محور Y نمودار بصورت مجزا، این مسئله برطرف میشود.
- منحنی‌های مشاهده شده برای هر کانال باید به‌شکل سیگموئیدی و یا دارای فاز لگاریتمی باشند.
- در هر یک از سه کانال FAM، HEX و Texas red مقادیر Ct کمتر از 34 بعنوان نتیجه‌ی مثبت و مقادیر بزرگتر از 34 بعنوان نتیجه‌ی منفی نظر گرفته شوند.
- نتایج مثبت، تاییدکننده‌ی قطعی عفونت با پاپیلوماویروس پرخطر و نتایج منفی رد کننده قطعی عفونت با پاپیلوماویروس پرخطر نیست و جواب‌های تست حاضر باید در ترکیب با یافته‌های بالینی، شرح حال بیمار و اطلاعات اپیدمیولوژیکی بکار گرفته شوند تا به نتیجه‌ی قطعی رسید.
- کنترل کیفی با استفاده از نتایج حاصل از کنترل‌های مثبت و منفی موجود در کیت انجام شود (شکل زیر):
| Brand | |
|---|---|
| CAT Number | DD030-001 |
| تست | 50 |
محصولات مرتبط
نقد و بررسی‌ها
هنوز بررسی‌ای ثبت نشده است.