در یک مطالعه اخیر که به سرور پیش چاپ ارسال شده است میدان تحقیق* در حال بررسی برای انتشار در اپی ژنتیک و کروماتین، محققان یک سیستم EpiEditing بسیار خاص را با استفاده از Cas9 غیرفعال شده کاتالیزوری (dCas9) برای دستیابی به متیلاسیون اسید دئوکسی ریبونوکلئیک (DNA) اختصاصی آلل توسعه داده و مشخص می کنند.
مطالعه: توسعه ویرایش اپی ژنوم فوق اختصاصی با متیلاسیون DNA آلل خاص هدفمند. اعتبار تصویر: Natali _ Mis / Shutterstock.com
*اطلاعیه مهم: میدان تحقیق گزارش‌های علمی مقدماتی را منتشر می‌کند که توسط همتایان مورد بررسی قرار نگرفته‌اند و بنابراین، نباید به‌عنوان نتیجه‌گیری، راهنمای عمل بالینی/رفتار مرتبط با سلامتی در نظر گرفته شوند یا به عنوان اطلاعات ثابت تلقی شوند.
زمینه
ویرایش اپی ژنومیک شامل برنامه ریزی مجدد دقیق مناطق ژنومی خاص با استفاده از ابزاری به نام EpiEditor است. EpiEditor معمولا از اجزایی مانند dCas9، DNMT3A/3L و اسید ریبونوکلئیک راهنما (RNA) (sgRNA) تشکیل شده است. با معرفی متیلاسیون به یک مکان خاص، بیان ژن را می توان تعدیل کرد.
ASM به طور خاص به تحویل هدفمند متیلاسیون به تنها یک آلل از یک مکان ژنومی اشاره دارد. در زمینه بیماری‌های ناشی از یک جهش غالب، می‌توان از متیلاسیون انتخابی آلل جهش یافته برای سرکوب بیان آن و در عین حال حفظ عملکرد ژن استفاده کرد.
در مورد مطالعه
در مطالعه حاضر، یک وکتور بیان sgRNA واحد با جایگزینی بخشی از ستون فقرات وکتور pMulti-sgRNA-LacZ-DsRed با کاست بیان sgRNA از وکتور AIO-mCherry ساخته شد.
برای اهداف با پلی‌مورفیسم‌های تک نوکلئوتیدی (SNPs) در ناحیه موتیف مجاور پروتو اسپیسر (PAM)، یک توالی ژنومی 20 نوکلئوتیدی (nt) در بالادست PAM به‌عنوان محل اتصال sgRNA انتخاب شد. در مقایسه، برای اهداف دارای SNP در ناحیه بذر sgRNA، یک توالی 20 nt در بالادست نزدیکترین PAM حاوی SNP استفاده شد.
sgRNA های انتخاب شده برای کارایی و اثرات بالقوه خارج از هدف با استفاده از CRIPOR و CCTop مورد ارزیابی قرار گرفتند. تشکیل DNA چهارگانه در ناحیه sgRNA با استفاده از QGRS Mapper آنالیز شد، در حالی که شبیه سازی وکتورهای بیان sgRNA با استفاده از اسمبلی گلدن گیت انجام شد. علاوه بر این، ترانسفکشن سلول‌های HEK293 با مخلوطی از dCas9-10x SunTag، scFv-DNMT3A/3L انجام شد.، و بردار بیان چند sgRNA.
نشانگرهای فلورسنت در هر پلاسمید گنجانده شد تا مرتب‌سازی سلول‌های سه‌گانه مثبت را تسهیل کند. DNA ژنومی استخراج شد، بی سولفیت تبدیل شد و در معرض آماده سازی کتابخانه برای توالی یابی نسل بعدی (NGS) قرار گرفت.
تجزیه و تحلیل متیلاسیون DNA نیز با استفاده از Trim Galore!، PEAR، bwameth و MethylDackel انجام شد. جداسازی RNA و سنتز DNA مکمل (cDNA) با تجزیه و تحلیل بیان با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن و تولید کتابخانه با واکنش زنجیره‌ای پلیمراز دو مرحله‌ای (PCR) دنبال شد. نسبت‌های بیان آللی برای ژن‌های دارای SNP در اگزون‌ها تعیین شد.
نتایج مطالعه
سلول‌های HEK293 به دلیل سهولت در جابجایی و راندمان انتقال بالا برای این مطالعه انتخاب شدند. برای جمع آوری داده ها در مورد SNP ها در ژنوم، از یک پایگاه داده عمومی استفاده شد. برآوردهای اولیه سطوح متیلاسیون DNA از داده های توالی یابی MBD2-pulldown تولید شده در مطالعه قبلی به دست آمد.
یک در سیلیکو جستجو برای شناسایی SNPها در CGIهای متیله نشده (جزایر CpG) واقع در مناطق پروموتر ژن انجام شد. نتایج جستجو بر اساس وجود SNP ها در نزدیکی سایت بالقوه PAM یا در ناحیه بذر یک sgRNA امیدوارکننده فیلتر شدند. چهارده ژن هدف با SNPهای مناسب شناسایی شدند که حداکثر سه sgRNA برای هدف قرار دادن هر آلل ژنی طراحی شده بودند.
آزمایش‌ها بر اساس محل SNP در sgRNA، از جمله ناحیه بذر، موقعیت دو دنباله PAM یا موقعیت PAM سه طبقه‌بندی شدند. SNP ها در ناحیه PAM که منجر به تغییر گوانین (G) به Y می شود، جایی که Y نشان دهنده سیستئین (C) یا تورین (T) است، ترجیح داده می شوند، زیرا این تغییرات بهترین تمایز scFv-DNMT3A/3L-sfGFP، dCas9-10x را نشان می دهند. SunTag-BFP و sgRNA-DsRed به سلول های HEK293 می سازند. آزمایش‌های کنترلی نیز با استفاده از یک sgRNA درهم بدون محل اتصال در ژنوم انسان انجام شد.
تأثیر ASM بر نسبت‌های بیان ژن اختصاصی آلل نیز تعیین شد. ژن‌های دارای SNP در اگزون‌ها انتخاب شدند و نسبت‌های بیان آللی تعیین شدند.
ASM منجر به تغییرات قابل توجهی در نسبت های بیان آللی برای ژن های ISG15-Seed2 و MRPL52-PAM3 شد. محققان همچنین علاقه مند به توسعه و توصیف سیستم های EpiEditing بسیار خاص با استفاده از dCas9 برای دستیابی به ASM بودند. یک نسخه بهبود یافته از DNMT3A/3L با کاهش فعالیت غیراختصاصی به عنوان بخش کاتالیزوری مورد استفاده قرار گرفت و از طریق سیستم SunTag برای تقویت سیگنال و دایمرسازی به کمپلکس sgRNA/dCas9 متصل شد.
SNPهای هتروزیگوت در ناحیه بذر ناحیه sgRNA یا PAM dCas9 برای دستیابی به تمایز آللی مورد هدف قرار گرفتند. کارایی متیلاسیون DNA هدفمند در بین اهداف متفاوت بود، با اکثر اهداف موفق به میانگین متیلاسیون DNA بیش از 50٪ در سایت های انتخاب شده CpG می رسید.
موفقیت ASM بر اساس سطح کلی ASM و نسبت افزایش متیلاسیون DNA در آلل های روی و خارج از هدف ارزیابی شد. موفق ترین آزمایش های ASM SNP را در منطقه PAM قرار داده بودند. متیلاسیون DNA ناخواسته آلل خارج از هدف می تواند از اتصال خارج از هدف کمپلکس sgRNA/dCas9 یا فعالیت هدفمند DNMT3A/3L ناشی شود.
نتیجه گیری
محققان مطالعه حاضر با موفقیت به متیلاسیون DNA اختصاصی آلل با استفاده از کمپلکس‌های sgRNA/dCas9 در سلول‌های HEK293 دست یافتند. این رویکرد جدید با ویژگی بالا، کارایی و پایداری متیلاسیون اختصاصی آلل همراه بود که تغییراتی را در نسبت آللی بیان ژن ایجاد کرد.
در مجموع، یافته‌های مطالعه پتانسیل کمپلکس‌های sgRNA/dCas9 را برای ویرایش اپی ژنوم خاص آلل و کاربرد آن‌ها در پزشکی شخصی نشان می‌دهد.
*اطلاعیه مهم: میدان تحقیق گزارش‌های علمی مقدماتی را منتشر می‌کند که توسط همتایان مورد بررسی قرار نگرفته‌اند و بنابراین، نباید به‌عنوان نتیجه‌گیری، راهنمای عمل بالینی/رفتار مرتبط با سلامتی در نظر گرفته شوند یا به عنوان اطلاعات ثابت تلقی شوند.